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豬瘟病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒

發布時間:2014-01-06 15:10:03

包裝規格:10頭份/盒;20頭份/盒;

用途

豬瘟病毒(CFSV)巢式反轉錄聚合酶鏈式反應(nRT-PCR)檢測試劑盒,用於檢測疑似感染動物的血清或組織中的豬瘟野毒株病毒(CFSV),適用於CFSV的檢測、診斷和流行病學調查。

原理

利用離心柱內矽基質膜提取RNA,在反轉錄酶的作用下,以 RNA為模板,引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在 TaqDNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環,使特異 DNA片段的拷貝數放大一倍。本試劑盒采用巢式PCR方法,經過第一次擴增循環32次,第二次擴增循環35次,增加了檢測的敏感性和可靠性,最終使擴增 DNA片段放大了數百萬倍。再將擴增 DNA片段進行電泳,經染色後,在紫外燈照下,肉眼可見到 DNA片段的擴增帶。本方法通過巢式RT-PCR擴增,利用引物的特異性降低了擴增多個靶位點的可能性,可以特異性地從組織樣品中檢測出豬瘟野毒株病毒。

試劑盒組成

*洗液Ⅰ首次使用前,請添加2.5ml10頭份)/5ml20頭份)100%乙醇。

*洗液首次使用前,請添加7ml10頭份)/14ml20頭份)100%乙醇。

需要自備的器材及試劑

器材:PCR擴增儀、電泳係統、紫外凝膠成像儀、可調移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、離心機、微波爐、一次性RNase Free吸頭(10µl200µl1000µl)、RNaseFree 1.5ml離心管、0.2mlPCR管。

試劑:瓊脂糖、Marker、核酸染色液、TAE電泳緩衝液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

使用注意事項

所有接觸病料的物品均應合理處理,以免造成人員傷害及汙染實驗室。

所有試劑應在規定的溫度儲藏,-20℃保存的各試劑使用前應放於室溫完全融化,使用後立即放回-20℃。

嚴格遵守操作說明可以獲得良好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

反複凍融試劑將減低檢測靈敏度,建議在3次內用完,請嚴格按照試劑盒說明書操作。

樣品製備

1樣品采集:病死或撲殺的豬,取扁桃體、淋巴結、脾髒等組織病變部與健康部交界處組織;待檢活豬,用注射器取血5ml28℃保存,送實驗室檢測。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反複凍融。)

2樣品處理:每份樣品分別處理。

2.1組織樣品處理:每份組織樣品分別從三個不同的位置稱取約3g,用手術剪剪碎混勻後,按照1:4加入PBS液於研磨器中研磨,勻漿後48000×g離心2min,取上清液200µl1.5ml滅菌離心管(自備)中。

2.2全血樣品處理:待血凝後取血清200µl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

2.3陽性對照處理:取陽性對照200µl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

2.4陰性對照處理:取陽性對照200µl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

操作步驟

1 病毒RNA提取

1.1 取已處理的樣品、陽性對照和陰性對照,分別加入200µl試劑Ⅰ,劇烈震蕩混勻,室溫放置3-5min

1.2 加入75µl試劑Ⅱ,混合均勻後,412000×g離心3-5min

1.3 將上清液轉移到新的2ml 收集管中,加入300µl 異丙醇,上下顛倒混勻。

1.4 將混勻液轉移至吸附柱中(提前將吸附柱安置於另一新的2ml收集管中),412000×g離心1min,棄濾液。注:若吸附柱中有液體殘留,可重複離心1 min

1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中,412000×g離心1min,棄濾液。

注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,412000×g離心1min,棄濾液。將吸附柱放回收集管中,412000×g離心1min

注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

1.7將吸附柱安置於新的1.5ml的離心管(自備)中,在吸附柱膜的中央處加入50µl洗脫液,室溫靜置3 min412000×g離心1min洗脫病毒RNA注:溶解的RNA應置於-20℃或者更低溫度環境下保存。

2 RT-PCR操作程序

 

第一次擴增:25µl體係,使用前每份中分別加入21µl RT-PCR反應液、1µl酶混合液和3µl1.7”中提取的模板RNA(注:使用時可根據情況適當稀釋),混勻後按照右側程序進行PCR擴增:


第二次擴增:25µl體係,使用前每份中分別加入22µl PCR反應液和3µl第一次擴增產物,混勻後按照右側程序進行PCR擴增:

 

 

3 電泳

2g瓊脂糖於250ml錐形瓶中,加入TAE電泳緩衝液200ml,於微波爐中熔解,再加入10µl核酸染色液混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固後將PCR擴增產物10µlMarker適量點樣於瓊脂糖凝膠孔中,以110-120V電壓於TAE電泳緩衝液中電泳30min,紫外燈下觀察結果。

結果判定

陽性對照在272bp處出現擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品在在272bp處出現擴增帶為豬瘟野毒株病毒陽性,否則為陰性。

 

附:本試劑盒A盒中附贈的TAE電泳緩衝液,使用時用雙蒸水或去離子水50倍稀釋後使用。


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