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口蹄疫病毒RT-PCR檢測試劑盒

發布時間:2014-01-23 13:55:03

用途

口蹄疫病毒(FMDV)反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測試劑盒,用於檢測疑似感染動物組織中的FMDV,適用於FMDV的檢測、診斷和流行病學調查。

原理

利用離心柱內矽基質膜提取RNA,在反轉錄酶的作用下,以 RNA為模板,引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環,使特異 DNA片段的拷貝數放大一倍。經過 35次循環,最終使擴增 DNA片段放大了數百萬倍。將擴增 DNA片段進行電泳,經染色後,在紫外燈照射下,肉眼可見到 DNA片段的擴增帶。

試劑盒組成

名稱

組分

10頭份

20頭份

貯藏條件

A

(核酸提取)

吸附柱   Spin Column

10(支)

20(支)

室溫

12個月

2ml收集管(Collection Tube

20(支)

40(支)

試劑Ⅰ(Reagent Ⅰ)

2.4ml

4.4ml

試劑Ⅱ(Reagent  

800μl

1.6ml

異丙醇(Isopropanol

5mL

8ml

洗液Ⅰ* Rinse Ⅰ)

3.5ml

7ml

洗液Ⅱ* Rinse Ⅱ)

3ml

6ml

洗脫液(Elution Buffer

600μl

1.1ml

B

RT-PCR檢測)

陽性對照(Positive Control

600μl

1ml

-20

6個月

陰性對照(Negative Control

600μl

1ml

RT-PCR反應液(RT-PCR reaction solution

231μl

462μl

酶混合液(Mixture enzyme

11μl

22μl

*洗液Ⅰ首次使用前,請添加2.5ml10頭份)/5ml20頭份)100%乙醇。

*洗液Ⅱ首次使用前,請添加7ml10頭份)/14ml20頭份)100%乙醇。

需要自備的器材及試劑

器材:PCR擴增儀、電泳係統、紫外凝膠成像儀、可調移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、離心機、微波爐、一次性RNase Free吸頭(10µl200µl1000µl)、RNase Free 1.5ml離心管、0.2mlPCR管。

試劑:瓊脂糖、Marker、核酸染色液、TAE電泳緩衝液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

使用注意事項

所有接觸病料的物品均應合理處理,以免造成人員傷害及汙染實驗室。

所有試劑應在規定的溫度儲藏,-20℃保存的各試劑使用前應放於室溫完全融化,使用後立即放回-20℃。

嚴格遵守操作說明可以獲得良好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

反複凍融試劑將減低檢測靈敏度,建議在3次內用完,請嚴格按照試劑盒說明書操作。

樣品製備

1樣品采集:采集3-5g待檢動物口腔和蹄部的結痂組織、水泡皮、水泡液或食道-咽部分泌物(O-P液)。28℃保存,送實驗室檢測。(水泡樣品采集部位可用清水清洗,切忌用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭;送檢病料要新鮮,嚴禁反複凍融。)

2樣品處理:每份樣品分別處理。

2.1組織樣品處理:取每份組織樣品(水泡皮、結痂組織等)約3g,用手術剪剪碎混勻後,按照1:4加入PBS液於研磨器中研磨,勻漿後48000×g離心2min,取上清液200µl1.5ml滅菌離心管(自備)中。

    2.2水泡液、O-P液樣品處理:取水泡液或O-P200ul,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

    2.3陽性對照處理:取陽性對照200µl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

    2.4陰性對照處理:取陰性對照200µl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

操作步驟

1 病毒 RNA提取

1.1 取已處理的樣品、陽性對照和陰性對照,分別加入200µl試劑Ⅰ,劇烈震蕩混勻,室溫放置3-5min

1.2 加入75µl試劑Ⅱ,混合均勻後,4 12000×g離心3-5min

1.3 將上清液轉移到新的2ml 收集管中,加入300µl異丙醇,上下顛倒混勻。

1.4 將混勻液轉移至吸附柱中(提前將吸附柱安置於另一新的2ml 收集管中),4 12000×g離心1min,棄濾 液。  注:若吸附柱中有液體殘留,可重複離心1 min

1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中, 4 12000×g離心1min,棄濾液。注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,4 12000×g離心1min,棄濾液。將吸附柱放回收集管中,4 12000×g離心1min注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

1.7 將吸附柱安置於新的1.5ml的離心管(自備)中,在吸附柱膜的中央處加入50µl洗脫液,室溫靜置3min4 12000×g離心1min洗脫病毒RNA注:溶解的RNA應置於-20℃或者更低溫度環境下保存。

2 RT-PCR操作程序

25µl體係: 使用前每份中分別加入21µl RT-PCR反應液、1µl酶混合液和3µl1.7”中提取的模板RNA(注: 使用時可根據情況適當稀釋),混勻後按照以下程序進行PCR擴增:

50    30min

95    3min

94    30s

55    30s       35個循環

72    40s

72    10min

3 電泳

2g瓊脂糖於250ml錐形瓶中,加入TAE電泳緩衝液200ml,於微波爐中熔解,再加入10µl核酸染色液混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固後將PCR擴增產物10µlMarker適量點樣於瓊脂糖凝膠孔中,以110-120V電壓於TAE電泳緩衝液中電泳30min,紫外燈下觀察結果。

結果判定

陽性對照在800bp左右處出現擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品在800bp左右處出現擴增帶為口蹄疫病毒陽性,否則為陰性。

  附:本試劑盒A盒中附贈的TAE電泳緩衝液,使用時用雙蒸水或去離子水50倍稀釋後使用。

 


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